Международной группе американских, французских и китайских ученых удалось создать полусинтетическую форму жизни. Несмотря на то, что ранее уже предпринимались попытки получить бактерии из видоизмененной ДНК, размножение микроорганизмов проходило плохо. Микроорганизмам требовались особые условия выращивания, и они в конечном итоге избавлялись от модификаций, которые в них внедрялись. В своих новых исследованиях ученым удалось решись все эти проблемы и получить существо, кардинально отличающееся от всех видом естественной жизни, существующих на планете.

Как известно, ДНК живых организмов состоит из нуклеотидов четырех видов, которые содержат аденин, гуанин, Тимин и цитозин. Отдельные хромосомы образуются из цепочек из множества нуклеотидов ( от десятков до сотен миллиардов). Гены, которые находятся в хромосомах, являются по сути длинными нуклеотидными последовательностями, содержащими в себе зашифрованные аминокислотные цепочки белков. Каждая комбинация из трех следующих друг за другом нуклеотидов соответствует какой-то из двадцати аминокислот. Иными словами, живые организмы используют генетический код, состоящий из трех букв, в основе которого лежит четырехбуквенный алфавит (C, G, A,T).

В том случае, если клетке организма требуется какой-либо полипептид (белок), включается ген, который его кодирует. К этому гену крепится фермент РНК-полимераза, фермент, который в ходе биосинтеза двигается вдоль цепочки нуклеотидов и создает копию последовательности в виде молекулы, которая называется информационной РНК. РНК схожа с ДНК, с тем лишь отличием, что в ней вместо Тимина содержится урацил. Информационная НК выходит за пределы ядра клетки и двигается в рибосомам, и там в ходе биосинтеза она является своего рода инструкцией по созданию аминокислотной последовательности белка.

В ходе исследований ученые решили внести изменения в ДНК-алфавит кишечной палочки, внеся в него две дополнительные буквы. ДНК всех живых организмов, как известно, двойная, то есть, образована двумя последовательностями, спаренными друг с другом взаимодополняющими связями. Эти связи формируются между началом А-нуклеотида в одной последовательности и началом Т-нуклеотида во второй цепочке. Такие же связи присутствуют между C и Gцепочками. По этой причине новые синтетические нуклеотиды также должны уметь соединяться, взаимодополняя друг друга. Для исследований были выбраны d5SICS и dNaM.
Одну пару синтетических нуклеотидов встроили в кольцевую молекулу ДНК, состоящую из двух цепочек – плазмиду, которая способна репродуцироваться отдельно от всего генома микроорганизма. Эти синтетические нуклеотиды были вставлены на место двух взаимодополняющих друг друга нуклеотидов А и Т, которые находились в составе цепи генов, осуществляющих превращение сахара лактозы, и некодирующих цепочек ДНК, связанных с ними. Синтетические нуклеотиды не входили в ту часть, которую полимераза воспроизводит в иРНК.

Ученые приняли решение синтетические нуклеотиды вставлять рядом с геном, а не в него. Все потому, что изменить ген в работоспособном состоянии подобным образом достаточно сложно. Для этого необходимо прикрепить полученные кодоны к какой-нибудь аминокислоте. В свою очередь, для этого необходимо научить клетку вырабатывать разные виды транспортных РНК, которые смогли бы узнавать эти кодоны.

Транспортные РНК на одном из концов несут определенную аминокислоту, в рибосомах подходят в информационной РНК и сверяют с кодоном триплет нуклеотидов на другом конце. В случае совпадения происходит открытие аминокислоты и встраивание ее в белок. В том случае, если ни одной подходящей РНК не выявлено, синтез белка не будет производиться, а это, в свою очередь, может оказать негативное воздействие на жизнеспособность клетки. Именно по этой причине, исследователям, после встраивания в гены синтетических нуклеотидов, необходимо было бы создать новые гены, которые кодировали бы новые транспортные РНК, распознающие искусственные кодоны и способные присоединять правильную аминокислоту к полипептиду. В то же время, задача ученых заключалась лишь в том, чтобы убедиться: плазмида в искусственными нуклеотидами сможет размножаться и передаваться порожденным организмам.

Плазмиду, получившую обозначение pINF, внесли в молекулу кишечной палочки. Но для ее дублирования необходимо наличие множества нуклеотидов внутри клетки микроорганизма. С этой целью в кишечную палочку поместили еще одну плазмиду — pCDF-1b, содержащую ген PtNTT2 диатомовой водоросли, кодирующий белок NTT, которые переносит нуклеотиды в клетку из питательной среды.

Нужно отметить, что перед учеными возникли определенные трудности. Основная проблема заключалась в том, что белки водоросли оказывали токсическое влияние на клетку кишечной палочки в силу того, что содержали фрагмент аминокислотной цепочки, несущей сигнальную функцию. Она помогает белку занимать в клетке водоросли правильное положение, затем эта аминокислотная последовательность удаляется. Кишечная палочка этот фрагмент удалять не может, поэтому ученые были вынуждены ей помочь. Им удалось удалить из NTT первые 65 аминокислот, что в значительной степени уменьшило токсичность, но в то же время привело к уменьшению скорости транспортировки нуклеотидов.

Еще одна проблема состояла в том, чтобы искусственные нуклеотиды сохранялись в плазмидах продолжительное время, и не заменялись при дублировании ДНК. Сохранность их, как было установлено, зависела от нуклеотидов, их окружавших. Для того, чтобы это установить, исследователям потребовалось проанализировать разные комбинации, которые были встроены в 16 плазмид. А для определения того, выпал ли искусственный нуклеотид из цепочки, была использована технология CRISPR/Cas9.

Данная технология является молекулярным механизмом, который существует внутри бактерий и который позволяет им противостоять бактериофагам. Данная технология, иными словами, является иммунитетом против вирусов.

CRISPR являются особыми участками ДНК, в которых содержатся небольшие фрагменты вирусов ДНК, когда-то заражавших предков современных бактерий, но побежденных их внутренней защитой.

После проникновения бактериофага внутрь бактерии, данные фрагменты используются как шаблон для репликации молекул crРНК. Формируется большое количество различных последовательностей РНК, которые связываются с белком Cas9. Основная цель этого белка заключается в разрезании ДНК-вируса. Он может это сделать после того, когда crРНК отыщет фрагмент вирусной ДНК, комплементарный ей.

В том случае, если использовать цепочку РНК, схожую с определенным фрагментом плазмиды, вместо crРНК, то белок разрежет и плазмиду. Однако, если в том фрагменты будут искусственные нуклеотиды, Cas9 не сработает. Иными словами, CRISPR помогает выделить устойчивые к нежелательным мутациям плазмиды. Как было установлено в ходе исследований, потери искусственных нуклеотидов у 13 плазмид из 16 были незначительными.

Исследователи тем самым создали организм с устойчивыми изменениями в ДНК, который может сохранять их очень долго.

Несмотря на то, что в геноме полусинтетической формы жизни присутствует всего два синтетических нуклеотида, не входящих в состав кодонов и не участвующих в кодировании аминокислот, она является первым устойчивым организмом с ДНК-алфавитом, состоящим из шести букв.

Вероятно, со временем ученые смогут использовать новое открытие для синтезирования белков, создав тем самым искусственный полноценный генетический код.

No related links found


Комментарии:

Leave a reply